Kunci Tak Terduga untuk Terapi Gen yang Aman: DNA Sampah Burung

Retrotransposon dapat memasukkan gen baru ke dalam “pelabuhan aman” dalam genom, melengkapi pengeditan gen CRISPR.

Pemberian lampu hijau baru-baru ini pada pengobatan CRISPR-Cas9 untuk penyakit sel sabit menggarisbawahi kemanjuran teknologi pengeditan gen dalam menonaktifkan gen untuk menyembuhkan penyakit keturunan. Namun, kemampuan untuk mengintegrasikan seluruh gen ke dalam genom manusia sebagai pengganti gen yang rusak atau berbahaya belum tercapai.

Sebuah teknik baru yang menggunakan retrotransposon dari burung untuk memasukkan gen ke dalam genom lebih menjanjikan untuk terapi gen, karena teknik ini memasukkan gen ke dalam “pelabuhan aman” dalam genom manusia di mana penyisipan tersebut tidak akan mengganggu gen penting atau menyebabkan kanker.

Retrotransposon, atau retroelemen, adalah bagian dari DNA itu, ketika ditranskripsikan ke dalam RNA, mengkode enzim yang menyalin RNA kembali ke DNA dalam genom — siklus swalayan yang mengacaukan genom dengan retrotransposon DNA. Sekitar 40% genom manusia terdiri dari DNA baru yang “egois” ini, meskipun sebagian besar gen dinonaktifkan, yang disebut DNA sampah.

Teknik baru ini, yang disebut Precise RNA-mediated Insertion of Transgenes, atau PRINT, mengeksploitasi kemampuan beberapa retrotransposon untuk secara efisien memasukkan seluruh gen ke dalam genom tanpa mempengaruhi fungsi genom lainnya. PRINT akan melengkapi kemampuan teknologi CRISPR-Cas yang telah diakui dalam menonaktifkan gen, menciptakan mutasi titik, dan menyisipkan segmen pendek DNA.

Deskripsi PRINT, yang dikembangkan di laboratorium Kathleen Collins, seorang profesor biologi molekuler dan sel di Universitas California, Berkeley, baru-baru ini diterbitkan di jurnal Bioteknologi Alam.

PRINT melibatkan penyisipan DNA baru ke dalam sel menggunakan metode pengiriman yang serupa dengan yang digunakan untuk mengangkut CRISPR-Cas9 ke dalam sel untuk pengeditan genom. Untuk PRINT, satu bagian RNA yang dikirim mengkodekan protein retroelemen umum yang disebut protein R2, yang memiliki banyak bagian aktif, termasuk nickase – enzim yang mengikat dan memotong DNA beruntai ganda – dan membalikkan transkriptase, enzim yang menghasilkan salinan DNA. RNA. Sisa RNA adalah cetakan untuk DNA transgen yang akan disisipkan, ditambah elemen kontrol ekspresi gen – seluruh kaset transgen otonom yang dimasukkan oleh protein R2 ke dalam genom, kata Collins.

Keuntungan utama menggunakan protein R2 adalah ia memasukkan transgen ke dalam area genom yang berisi ratusan salinan identik dari gen yang sama – masing-masing mengkode RNA ribosom, mesin RNA yang menerjemahkan messenger RNA (mRNA) menjadi protein. Dengan banyaknya salinan yang berlebihan, ketika penyisipan mengganggu satu atau lebih gen RNA ribosom, hilangnya gen tersebut kemungkinan besar tidak akan terlewatkan.

Menempatkan transgen di lokasi yang aman akan menghindari masalah besar yang dihadapi saat memasukkan transgen melalui manusia virus vektor, yang merupakan metode umum saat ini: Gen sering kali dimasukkan secara acak ke dalam genom, sehingga menonaktifkan gen yang bekerja atau mengganggu regulasi atau fungsi gen, sehingga berpotensi menyebabkan kanker.

“Pendekatan berbasis CRISPR-Cas9 dapat memperbaiki nukleotida mutan atau memasukkan sejumlah kecil perbaikan urutan DNA. Atau Anda dapat menghilangkan fungsi suatu gen dengan mutagenesis spesifik lokasi,” kata Collins, yang menjabat sebagai Ketua Keluarga Walter dan Ruth Schubert. “Kami tidak menghilangkan fungsi gen tersebut. Kami tidak memperbaiki mutasi gen endogen. Kami mengambil pendekatan yang saling melengkapi, yaitu memasukkan ke dalam genom sebuah gen yang diekspresikan secara otonom yang membuat protein aktif – untuk menambahkan kembali gen yang berfungsi sebagai bypass defisit. Ini adalah suplementasi transgen, bukan pembalikan mutasi. Untuk memperbaiki penyakit hilangnya fungsi yang timbul dari mutasi individu pada gen yang sama, ini sangat baik.”

'Pemenang sesungguhnya datang dari burung'

Banyak penyakit keturunan, seperti fibrosis kistik dan hemofilia, disebabkan oleh sejumlah mutasi berbeda pada gen yang sama, yang semuanya menonaktifkan fungsi gen tersebut. Terapi pengeditan gen berbasis CRISPR-Cas9 harus disesuaikan dengan mutasi spesifik individu. Suplementasi gen menggunakan PRINT dapat memberikan gen yang benar kepada setiap orang yang menderita penyakit ini, memungkinkan tubuh setiap pasien membuat protein normal, terlepas dari mutasi aslinya.

Banyak laboratorium akademis dan perusahaan rintisan sedang menyelidiki penggunaan transposon dan retrotransposon untuk menyisipkan gen untuk terapi gen. Salah satu retrotransposon populer yang sedang dipelajari oleh perusahaan bioteknologi adalah LINE-1 (Long Interspersed Element-1), yang pada manusia telah mereplikasi dirinya sendiri dan beberapa gen penumpang untuk mencakup sekitar 30% genom, meskipun terdapat kurang dari 100 retrotransposon LINE-1 di genom kita. . salinannya masih berfungsi sampai sekarang, hanya sebagian kecil dari genom.

Collins, bersama dengan rekan pascadoktoral UC Berkeley Akanksha Thawani dan Eva Nogales, Profesor Terhormat UC Berkeley di Departemen Biologi Molekuler dan Sel dan peneliti Howard Hughes Medical Institute, menerbitkan struktur mikroskop krioelektron dari protein enzim yang dikodekan oleh retroelemen LINE-1 pada 14 Desember di jurnal Alami.

Studi ini memperjelas, kata Collins, bahwa protein retrotransposon LINE-1 akan sulit direkayasa untuk memasukkan transgen ke dalam genom manusia dengan aman dan efisien. Namun penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa gen yang dimasukkan ke dalam wilayah pengkodean RNA ribosom berulang pada genom (rDNA) dapat diekspresikan secara normal, menyarankan kepada Collins bahwa retroelemen berbeda, yang disebut R2, mungkin bekerja lebih baik untuk penyisipan transgen yang aman.

Karena R2 tidak ditemukan pada manusia, Collins dan peneliti senior Xiaozhu Zhang dan rekan pascadoktoral Briana Van Treeck, keduanya dari UC Berkeley, menyaring R2 dari lebih dari sejumlah genom hewan, mulai dari serangga hingga kepiting tapal kuda dan eukariota multiseluler lainnya, untuk menemukan versi yang sangat ditargetkan pada wilayah rDNA dalam genom manusia dan efisien dalam memasukkan DNA dalam jumlah besar ke wilayah tersebut.

“Setelah mengejar lusinan individu, pemenang sebenarnya datang dari burung,” kata Collins, termasuk kutilang zebra dan burung pipit tenggorokan putih.

Meskipun mamalia tidak memiliki R2 dalam genomnya, mereka memiliki situs pengikatan yang diperlukan agar R2 dapat disisipkan secara efektif sebagai retroelemen. Ini kemungkinan besar merupakan tanda, katanya, bahwa nenek moyang mamalia memiliki retroelemen seperti R2 yang entah bagaimana dihilangkan dari genom mereka. genom mamalia.

Dalam percobaan tersebut, Zhang dan Van Treeck mensintesis protein R2 yang mengkode mRNA dan cetakan RNA yang akan menghasilkan transgen dengan protein fluoresen yang diekspresikan oleh promotor RNA polimerase. Ini ditransfusikan ke dalam sel manusia yang dikultur. Sekitar setengah dari sel bersinar hijau atau merah karena ekspresi protein fluoresen di bawah sinar laser, menunjukkan bahwa sistem R2 telah berhasil memasukkan protein fluoresen fungsional ke dalam genom.

Penelitian lebih lanjut menunjukkan bahwa transgen memang cocok dengan wilayah rDNA genom dan sekitar 10 salinan templat RNA dapat disisipkan tanpa mengganggu aktivitas pembuatan protein gen rDNA.

Pusat biogenesis ribosom raksasa

Memasukkan transgen ke dalam wilayah rDNA genom bermanfaat untuk alasan selain menyediakan tempat berlindung yang aman. Daerah rDNA ditemukan pada lengan lemak dari lima kromosom terpisah. Semua lengan gemuk ini bersatu membentuk struktur yang disebut nukleolus, tempat DNA ditranskripsi menjadi RNA ribosom, yang kemudian dilipat menjadi mesin ribosom yang menghasilkan protein. Di dalam nukleolus, transkripsi rDNA sangat diatur, dan gen mengalami perbaikan cepat, karena setiap kerusakan rDNA, jika dibiarkan menyebar, dapat menghentikan produksi protein. Hasilnya, setiap transgen yang dimasukkan ke dalam wilayah rDNA genom akan diproses dengan baik di nukleolus.

“Nukleolus adalah pusat biogenesis ribosom raksasa,” kata Collins. “Tetapi ini juga merupakan lingkungan perbaikan DNA yang sangat istimewa dengan risiko onkogenik yang rendah akibat penyisipan gen. Sungguh menakjubkan bahwa unsur-unsur retro yang sukses ini – saya mengantropomorfkannya – berhasil masuk ke dalam DNA ribosom. Ini adalah multikopi, dilestarikan, dan merupakan pelabuhan yang aman dalam arti bahwa Anda dapat mengganggu salah satu salinan ini dan sel tidak akan peduli.”

Hal ini menjadikan wilayah ini tempat yang ideal untuk memasukkan gen untuk terapi gen manusia.

Collins mengakui bahwa masih banyak yang belum diketahui mengenai cara kerja R2 dan masih terdapat pertanyaan mengenai biologi transkripsi rDNA: Berapa banyak gen rDNA yang dapat diganggu sebelum sel dapat berfungsi? Karena beberapa sel mematikan 400+ gen rDNA dalam genom manusia, apakah sel-sel ini lebih rentan terhadap efek samping PRINT? Dia dan timnya sedang menyelidiki pertanyaan-pertanyaan ini, tetapi juga menyesuaikan berbagai protein dan RNA yang terlibat dalam penyisipan retroelemen untuk membuat PRINT bekerja lebih baik pada sel yang dikultur dan sel primer dari jaringan manusia.

Namun, intinya adalah “berhasil,” katanya. “Hanya saja kita harus memahami lebih jauh tentang biologi rDNA kita agar dapat benar-benar memanfaatkannya.”

Referensi: “Memanfaatkan protein retroelemen eukariotik untuk penyisipan transgen ke lokus pelabuhan aman manusia” oleh Xiaozhu Zhang, Briana Van Treeck, Connor A. Horton, Jeremy JR McIntyre, Sarah M. Palm, Justin L. Shumate dan Kathleen Collins, 20 Februari 2024 , Bioteknologi Alam.
DOI: 10.1038/s41587-024-02137-y

Rekan penulis lainnya dari Bioteknologi Alam makalah adalah mahasiswa pascasarjana UC Berkeley Connor Horton, Jeremy McIntyre, Sarah Palm, dan Justin Shumate. Pekerjaan ini didukung oleh Institut Kesehatan Nasional (F32 GM139306, DP1 HL156819, T32 GM07232) dan Yayasan Shurl dan Kay Curci. Collins telah mengajukan paten untuk PRINT, dan ikut mendirikan perusahaan, Addition Therapeutics, untuk mengembangkan lebih lanjut PRINT sebagai terapi gen.